О методике получения PRP
Как готовиться обогащёнными тромбоцитами плазма
У пациента берется венозная кровь непосредственно перед процедурой, которая помещается в емкость с антикоагулянтом. После этого кровь центрифугируется. В результате прокручивания на центрифуге происходит отслоение форменных элементов от плазмы. Поскольку эритроциты являются более тяжелыми клетками, они оседают вниз в виде красного осадка. Тромбоциты – клетки чуть меньше и легче эритроцитов, поэтому они остаются на границе слоев. При этом на самом верху тромбоцитов наименьшее количество. Этот слой называется PPP (platelet poor plasma) – бедная тромбоцитами плазма. Если мы используем разделительный гель, некоторые методики предлагают и такой набор препаратов, то тромбоциты остаются в верхней части плазмы. Таким образом, осуществляется более диффузное распределение тромбоцитов, нет четкого расслоения и разницы по концентрации.
Антикоагулянты, используемые при получении PRP
Гепарин, EDTA – необратимо ингибируют способность тромбоцитов к агрегации.
Цитрат натрия, ACD-А — в отличие от антикоагулянтов, указанных выше, ингибируют агрегацию тромбоцитов обратимо, при этом не повреждается клеточная мембрана.
Количество тромбоцитов в PRP
Ситуация рассмотрена на примере одного из пациентов. Изначальное количество тромбоцитов было не большое – 190 000 на 1 микролитр плазмы. После первого центрифугирования с использованием пробирки и разделительного геля, в верхней части пробирки осталось количество тромбоцитов в 2-2,5 раза превышающее изначальное значение. Если мы не используем разделительный гель, в нижнем слое плазмы тромбоцитов в 7,9 раз больше. Выяснилось и то, что в PPP тоже остается какая-то часть тромбоцитов.
В верхней части эритроцитарного слоя содержится, так называемый, лейкоцитарный слой, потому что лейкоциты тоже легче эритроцитов. Выяснили, что этот лейкоцитарный слой также содержит какое-то количество тромбоцитов. И разработчики метода задумались:
— Если мы хотим получить концентрированную PRP, то зачем нам терять это драгоценное количество клеток.
Оказалось, что если сбросить основную эритроцитарную массу, и, оставив небольшое количество эритроцитов с лейкоцитами и тромбоцитами, прокрутить на центрифуге второй раз, то количество тромбоцитов в плазме увеличивается еще больше.
— Что будет, если активировать процесс свертывания в плазме? Это увеличит концентрацию факторов роста и цитокинов в PRP?
Для решения этой проблемы были проведены эксперименты с добавлением ионов кальция или аутологичного тромбина (разные методики предполагают разные способы активации плазмы). Было решено подсчитать количество факторов роста в плазме в случае активации процессов свертывания.
Обнаружено, что уровень некоторых факторов роста увеличивается почти в 140 раз.
Также были попытки активировать и бедную плазму, потому что и там есть часть тромбоцитов. Выяснилось, что при активации бедной плазмы, количество факторов роста в плазме также увеличивается в несколько раз.
Как факторы роста влияют на пролиферацию клеток?
В эксперименте in vitro стволовые клетки и фибробласты кожи человека были обработаны факторами роста из обогащённой плазмы. Полученные данные показали, что пролиферация стволовых клеток и фибробластов заметно усилилась в присутствии активной PRP.
Выводы
1. При центрифугировании количество тромбоцитов гораздо больше, чем в цельной крови.
Насколько больше – зависит от методики, которая применяется при изготовлении плазмы.
2. Активация плазмы приводит к увеличению количественного содержания в ней факторов роста.
3. Добавление факторов роста из PRP in vitro усилили пролиферацию стволовых клеток и фибробластов.
